Ponudba storitev

Mastitis- analiza PCR

PathoProof™ Mastitis PCR Assay je metoda, namenjena odkrivanju mikrobnih povzročiteljev mastitisa v vzorcih kravjega mleka. Gre za metodo, ki temelji na verižni reakciji s polimerazo v realnem času (real-time PCR) in omogoča identifikacijo 12 najpogostejših povzročiteljev mastitisa. Identifikacija povzročitelja mastitisa je pomembna, saj se ukrepi in zdravljenje infekcij razlikujejo glede na povzročitelja. Ko povzročitelja enkrat poznamo, so lahko kontrolni ukrepi ciljno oblikovani.

Namen metode

  • Odkrivanje povzročiteljev akutnega mastitisa
  • Odkrivanje povzročiteljev subkliničnega mastitisa (v povezavi s povišanim številom somatskih celic)
  • Odkrivanje kužnih latentnih povzročiteljev mastitisa v čredi
  • Preventivno ugotavljanje prisotnosti povzročiteljev mastitisa (npr. pred cepljenjem živali proti povzročitelju, pred nakupom/vključitvijo nove živali v čredo, pred predvideno presušitvijo živali…)

Prednosti metode

  • Točnost in zanesljivost rezultatov
  • Možnost analiziranja konzerviranih in zamrznjenih vzorcev
  • Hitra diagnostika brez kultivacije mikroorganizmov- od vzorca do rezultatov v samo 4 urah
  • Možnost proporcionalnega določanja mikroorganizmov v primeru več različnih povzročiteljev

Vzpostavljena je mreža sodelovanja z organizatorji odkupa mleka in Kmetijskim inštitutom Slovenije (KIS). Vzorcem, oddanim v analizo, naj bo priložen zapisnik o odvzemu vzorcev. Na željo naročnika/lastnika živali lahko laboratorij rezultate analiz posreduje lokalnemu/hišnemu veterinarju, kateremu smo na voljo tudi za izmenjavo izkušenj, mnenj in drugo svetovanje v zvezi z interpretacijo rezultatov in priporočenimi ukrepi.

Analize surovega mleka

Preiskave surovega mleka opravljamo za komercialne potrebe (plačevanje mleka), za izvajanje uredbe o uvedbi dajatve za mleko in mlečne proizvode (U. list RS, št. 10/05 in 132/06), ter za izvajanje zahtev uredbe ES 853/04 za izpolnjevanje meril surovega mleka.

V laboratoriju za analize surovega mleka na željo naročnika opravljamo naslednje preiskave:

Določanje skupnega števila mikroorganizmov z metodo pretočne citometrije

Določanje skupnega števila mikroorganizmov v mleku z metodo pretočne citometrije je kvantitativno vrednotenje vsebnosti bakterij v mleku, na podlagi katerega določamo mikrobiološko kvaliteto mleka. S štetjem posameznih bakterijskih celic določamo individualno baktoskansko število (IBC, angl. Individual Bacteria Count ). Analizo izvajamo z aparatom Bactoscan FC (FOSS), ki je namenjen avtomatskemu, hitremu in zanesljivemu štetju bakterij v surovem mleku.

Princip metode

V aparatu se bakterijske celice obarvajo s fluorescenčnim barvilom, ostale mlečne komponente pa se razgradijo in dispergirajo, tako da je bakterije možno prešteti. Fluorescentni detektor zazna emitirajočo svetlobo, ki jo oddajajo obarvane bakterije, ki potujejo kot tanek curek skozi pretočno celico pod detektorjem. Svetlobni pulzi se pretvorijo v električne, ti pa se preštejejo in prikažejo na zaslonu računalnika.

Konverzija

Vrednosti, ki jih podajamo kot rezultate, so v enotah referenčne metode (ISO 4833-štetje kolonij na petrijevih ploščah pri 30°C), to je CFU/ml (angl. colony forming units = kolonjiske enote). Za pretvorbo IBC v CFU je potrebna konverzijska krivulja, ki je bila narejena na podlagi številnih meritev in primerjav med izmerjenimi vrednostmi IBC in številom kolonijskih enot-CFU na petrijevih ploščah. Vsi laboratoriji v Sloveniji uporabljamo isto konverzijsko krivuljo, tako da so rezultati med laboratoriji primerljivi.

99% rezultatov, ki jih izmerimo, je v akreditiranem območju od 3.000 do 1.000.000 cfu/ml.

Določanje kemijske sestave mleka (vsebnost mlečne maščobe, beljakovin, laktoze, suhe snovi brez maščobe, uree, zmrziščne točke z metodo infrardeče spektrometrije) po standardu IDF 141

Posamezne komponente mleka merimo na aparatu MilkoScan FT 6000, ki deluje na osnovi FTIR (angl. Fourier Transform Infrared Spectroscopy) tehnologije. Gre za metodo IR interferometrije, kjer enota FTIR posname celoten infrardeči spekter istočasno, kar aparatu omogoča merjenje različnih komponent. Parametri, ki jih izmerimo, so: maščobe, beljakovine, laktoza, urea, suha snov brez maščobe, zmrziščna točka- FPD (angl. Freezing Point Depression).

Princip metode

MilkoScan FT 6000 vsebuje sistem infrardeče svetlobe z enojnim žarkom, ene kivete in enega detektorja. Sistem temelji na FTIR tehniki, ki vključuje namensko izdelan interferometer z vsebnostjo vseh valovnih dolžin infrardečega spektra od 2 do 10µm. Usmerja jih svetlobna leča. Kiveta z vzorcem je nameščena za lečo. Diamantna okenca, z zelo ozkim medprostorom, sta visoko prepustna za infrardečo svetlobo in sta zelo obstojna. Količina infrardeče svetlobe, ki ga vzorec ne resorbira, preide na detektor.

FT (Furier Transform) je matematična tehnika, ki omogoča razcepitev interferograma v vsoto sinusnih funkcij, ki vsaka zase predstavlja svojo valovno dolžino. Frekvenca in amplituda valovne dolžine je izračunana iz podatkov interferograma.

Interferogram, ki ga ujame spektrometer in gre skozi FT tehniko izračuna, se pretvori nazaj v celoten IR spekter vzorca. Od tu naprej se ponovno srečamo s teorijo spektrometrije, intenziteto svetlobe, absorbanco, transmisijo in njihovo povezavo s posameznimi sestavinami v posameznem vzorcu.

Kalibracija

Na aparatu FT 6000 lahko merimo več parametrov hkrati. Vsako komponento kalibriramo posebej. V ta namen se na aparatu odpre program, ki je namenjen posameznemu parametru.

Za kalibracijo uporabljamo vzorce znane vrednosti, katerih vrednost je določena z referenčno metodo. Za maščobe je to metoda Rose Gottlieb (IDF 1D), za beljakovine metoda po Kjeldalu (IDF 20B) in za laktozo encimatska metoda- diferencialna pH-metrija (IDF 214).

Mlečne maščobe merimo v surovem mleku, glavnina rezultatov, ki jih izmerimo,je v akreditiranem območju. Območje akreditacije za maščobe je med 2,5 in 5,4 % (g/100g), za beljakovine med 2,5 in 4,2 % (g/100g) ter za laktozo med 4,1 in 4,8 % (g/100g).

Akreditirano območje merjenja zmrziščne točke na MilkoScanu je -0,545°C do -0,480°C.

Določanje skupnega števila somatskih celic (z metodo pretočne citometrije) po standardu ISO 13366-2

Skupno število somatskih celic merimo na aparatu Fossomatic FM 5000.

Štetje somatskih celic pomeni štetje belih krvnih celic v mleku. Te so del telesnega imunskega sistema in se borijo proti mehaničnim in mikrobiološkim povzročiteljem vnetja. Visoko število somatskih celic kaže na veliko tveganje za mastitis pri kravah.

Pretočna citometrija temelji na pretoku vzorca skozi zelo majhno kapilaro, kjer se nahaja števec. Obdelan vzorec, pomešan z nosilno tekočino, pod visokim tlakom potuje skozi kapilaro, ki dovoljuje prehod somatskih celic le zaporedoma.

Pred pretokom skozi kapilaro se mleko pomeša s fluorescentnim barvilom, ki obarva DNKmolekule v somatskih celicah. V kiveti je vzorec osvetljen z modro svetlobo, obarvane somatske celice pa po osvetlitvi emitirajo rdečo svetlobo, ki jo prestreže detektor. Fotopomnoževalka posamezne signale emitirane svetlobe celic prešteje.

Akreditirano območje merjenja je med 20.000 in 1.000.000 sc/ml vzorca.

Določanje zmrziščne točke (termistorska metoda) po standardu ISO 5764

Metoda se uporablja za določanje zmrziščne točke mleka- FPD (angl. Freezing Point Depression) in je za ta parameter referenčna metoda. Z njo ugotavljamo poneverbo oziroma dodajanje vode mleku.

Večinoma jo uporabljamo kot potrditveno metodo (referenčna) za meritve zmrziščne točke na MilkoScanu.

Princip

Vzorec mleka s pomočjo instrumenta podhladimo do primerne temperature (-3°C±1) in ko je vzorec dovolj hladen, z mehaničnim sunkom mešala povzročimo kristalizacijo in vzorec zamrznemo. Ob tem se sprosti toplota, tako da se temperatura vzorca prične dvigovati. Temperatura doseže nivo (plato) zmrzišča in traja toliko časa, dokler sta v ravnovesju tekoča in trdna faza. Temperatura je konstantna ( se ne spremeni za več kot 0,5m°C vsaj 20 sek). To je zmrziščna točka mleka, izražena v °C ali m°C.

Akreditirano območje merjenja pri tej metodi je od -0,408°C do -0,600°C.

Določanje zaviralnih snovi v mleku (z metodo detekcije inhibicije rasti mikroorganizmov)

Metoda se uporablja za ugotavljanje zaviralnih snovi v vzorcih mleka individualnih proizvajalcev, v vzorcih iz prevoznih cistern ter drugih primerih, ko se sumi na prisotnost zaviralnih substanc. Gre za kvalitativno določanje zaviralnih snovi v mleku.

Princip

BRT (Briliantschwarz- Reduktiontest) test je agar difuzijski test, ki deluje na občutljivosti določenih vrst mikroorganizmov, t.i. testnih bakterij, za antibiotike, sulfonamide in druge zaviralne snovi. Inhibitorji preprečijo metabolično aktivnost in rast testnih bakterij. Rast testnih kultur (B. stearotermophilus var. calidolactis C953) povzroča redukcijo specifičnega indikatorja briliant črno, kar vodi k spremembi barve testa (iz modrega v rumeno). Če so prisotni inhibitorji, ne bo redukcije barvnega indikatorja in ta bo ostal moder.

Metoda traja 2 uri in 30 minut z možnim podaljšanjem 15 minut.
Rezultat je podan kot poz./neg.

Določanje antibiotikov v mleku (hitre presejalne metode)

Antibiotike v mleku (surovo ali termično obdelano) določamo s testom Twinsensor. Gre za test na osnovi receptorja v obliki testnih trakcev za hitro detekcijo ß-laktamskih in tetraciklinskih molekul, prisotnih v vzorcu mleka. Metoda se uporablja v vzorcih surovega mleka v bazenu in tudi v individualnih vzorcih mleka.

Test zahteva 3 minutno inkubacijo reagenta na 40°C in 3 minutno migracijo na testnem trakcu pri 40°C.

Občutljivost testa zagotavlja ugotovitev prisotnosti antibiotikov v območju zakonske meje za ß-laktamske antibiotike (4ppb) in tetracikline (100 ppb). Rezultat je podan kot poz./neg.

Določanje aflatoksinov v mleku (hitra presejalna metoda)

Aflasensor je hitri test, ki omogoča detekcijo prisotnosti aflatoksina M1 v vzorcih surovega in pasteriziranega mleka. Aflasensor je kompetitivni test, ki vključuje specifična protitelesa z visoko afiniteto za aflatoksinske M1 molekule.

Test zahteva 3 minutno inkubacijo reagenta na 40°C in 7 minutno migracijo na testnem trakcu pri 40°C (uporaba grelca HeatSensor). Rezultati se odčitajo direktno z vizualno interpretacijo opazovanja testne črte ali pa uporabimo napravo za odčitavanje Readsensor. Občutljivost testa aflatoxin M1 je 0,1 ppb (angl. Parts Per Billion) z vizualnim odčitavanjem in 0,05 ppb s čitalcem Readsensor.

Rezultat je podan kot poz./neg.

Embalaža

Za vzorčenje v laboratoriju uporabljamo tako povratno (Bartek) kot tudi nepovratno embalažo. Obe sta OPREMLJENI s črtno kodo, ki mora biti na embalaži nalepljena na pravi višini, da lahko čitalec na aparatu kodo tudi odčita. Laboratorij omogoča tudi termodezinfekcijo povratne embalaže.

Analize mlečnih izdelkov

Na področju analiz mlečnih izdelkov za zunanje naročnike opravljamo:

Določevanje vsebnosti maščobe, beljakovin, suhe snovi, maščobe v suhi snovi, NaCl v mlečnih izdelkih.

Za določanje kemijskih parametrov (določanje vsebnosti maščob, beljakovin, suhe snovi, vlage, soli, vrednosti pH,…) v mlečnih izdelkih (jogurt, skuta, kisla smetana, maslo, sir) uporabljamo Aparat Foodscan ™ Lab.

Aparat Foodscan ™ Lab izvaja meritve na osnovi infrardeče tehnologije, s pomočjo katere lahko istočasno in točno določimo več parametrov.

Princip

Svetloba, ki jo oddaja volframova žarnica, je vodena preko optičnih vlaken na monokromator, katerega funkcija je zagotoviti monokromatično svetlobo spektra od 850 nm do 1050 nm. Skozi optična vlakna proseva svetloba do sistema leč, ki je nameščen v delovni enoti, kjer se izvaja meritev vzorca (prostor za postavitev petrijevke). Ta svetloba presvetli vzorec in neabsorbiran del zazna detektor, ki izmeri količino prejete svetlobe, ki je vzorec ni absorbiral. Detektor pošlje rezultat na digitalni signalni procesor (DSP), ki je povezan z računalniškim sistemom, ki nato z uporabo kalibracije preračuna rezultate.

Med izvedbo analize se vzorec v delovni enoti aparata vrti, kar omogoča analiziranje različnih delov vzorca. Tako je končen rezultat analize rezultat povprečja večih podvzorcev, kar daje bolj reprezentativen rezultat tudi, če gre za nehomogeniziran vzorec.

Priprava vzorca

Posebna priprava vzorca ni potrebna. Za analizo potrebujemo dobro premešan in homogen vzorec. Predpriprava vzorca je potrebna pri sirih in skuti. Pri sirih postopamo tako, da vzorec najprej zmeljemo v rezalniku, pri skuti in sirnem namazu pa vzorec zmešamo in čim bolj razdrobimo v terilnici.

Temperaturne zahteve vzorcev niso posebej omejene, je pa priporočeno, da se analize vselej izvaja pri isti temperaturi vzorcev.

Trajanje meritev: nekaj sekund

Siri:

Skuta:

Določevanje vsebnosti maščobe, beljakovin, suhe snovi, maščobe v suhi snovi, pH.

Fermentirani mlečni izdelki (jogurti, kislo mleko, kisla smetana):

Določevanje vsebnosti maščobe, beljakovin, pH, viskoznost.



Viskoznost izdelkov merimo z viskozimetrom proizvajalca Brookfield.